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随着基因编辑技术的发展，科学家们不断探索如何在体内环境中更精确地理解基因功能。近期，一项发表于《Nature Biotechnology》的研究《CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models》引入了CRISPR-StAR（CRISPR Screening with Transient Activity and Repression）技术，这一创新方法不仅克服了传统体内遗传筛选的局限性，还揭示了新的治疗靶点，为临床研究带来了曙光。
在肿瘤生物学中，细胞与细胞外基质、免疫系统和内皮及间质细胞之间的相互作用共同塑造了肿瘤的发展。然而，这些复杂的互动使得体外实验难以完全模拟体内环境，特别是在存在完整免疫系统的条件下。因此，许多治疗靶点仅在体内显现，强调了在活体中研究基因功能的重要性。虽然高通量体内遗传筛选已揭示了一些生理相关的新靶点，但受限于实验噪音和移植效率低等问题，这些研究往往局限于小规模的扰动库或易于移植且高度转化的移植瘤模型。
针对上述挑战，研究人员开发了CRISPR-StAR，通过激活每个细胞后代中的一半sgRNA来生成内部对照，从而解决了瓶颈效应和细胞群体生物异质性的问题。这项技术允许在单细胞衍生的克隆中产生内在控制，克服了固有和外来异质性以及瓶颈中的遗传漂移。
利用CRISPR-StAR，团队对小鼠黑色素瘤进行了全基因组范围的体内筛选，鉴定出了特定于体内的遗传依赖关系。例如，在ERK信号通路驱动的肿瘤中，Mapk1的缺失导致了细胞在体内正向选择，而在体外则相反；类似地，Inppl1的丢失也在体内显示了正向选择，这可能是因为它减弱了EGFR回收过程，进而抑制ERK信号传导。此外，该研究还在多个物种间验证了遗传依赖性的保守性，进一步证明了CRISPR-StAR的有效性和广泛应用潜力。
图1：CRISPR-StAR克服了实验噪声
在传统的CRISPR-Cas9体内筛查中，转导效率和克隆性细胞生长动力学的异质性常常引入实验噪声，阻碍了对sgRNA群与已建立肿瘤之间有意义的比较（图1a）。研究表明，在使用传统CRISPR文库进行体内筛查时，大多数恢复的条形码仅占总读取次数的1-5%，而少数条形码却占据了超过50%的肿瘤质量（图1b），这表明存在显著的实验噪声。
为了解决这些问题，研究者们开发了一种称为CRISPR-StAR的新方法，该方法通过独特分子标识符（UMI）条形码标记单细胞衍生克隆，并设计了一种创新的可诱导sgRNA构建体来生成内部对照，从而有效控制内在和外在异质性（图1c）。
CRISPR-StAR的核心在于它利用了一对嵌入式lox5171位点，这些位点与标准的loxP位点不兼容，使得Cre活性可以产生两种不同的重组结果——要么切除停止盒使sgRNA活跃，要么切除tracr RNA保持非活动状态。这两种重组事件都是不可逆且相互排斥的。通过三苯氧胺诱导Cre::ERT2重组酶，可以在单细胞水平上建立克隆，并由UMI追踪，满足所有内部控制筛选的要求（图1d）。
这种新方法的优势在于它能够在低覆盖率的情况下依然提供高度一致的结果。具体来说，当覆盖度达到每种sgRNA超过256个细胞时，靶向核心必需基因的sgRNA表现得非常稳定，而中性sgRNA的表现范围则超过了1,000倍（图1e、f）。相比之下，传统方法在低覆盖率下表现出极大的噪音，导致难以区分必需基因和非必需基因。CRISPR-StAR范式的重现性远高于传统分析，在所有条件下均保持在0.68以上，尤其是在低覆盖率情况下，显示出了明显优于传统方法的性能（图1g、h）。
总之，CRISPR-StAR技术通过引入独特的UMI条形码系统和改进的sgRNA构建体，成功地减少了实验噪声，提高了数据质量和可靠性。
图2：使用CRISPR-StAR优化体内混合筛选设置
为了确保CRISPR-StAR技术的读出结果稳健可靠，研究者们专注于优化控制群体（sgRNA处于非活性状态）与实验群体（sgRNA处于活跃状态）之间的平衡比例。最初的载体设计使得UMI克隆中约35-41%的细胞具有活跃的sgRNA，这限制了基因耗竭的动力范围。为此，研究人员通过调整loxP或lox5171位点间的序列上下文和距离，改进了载体设计，最终构建了StAR 4GN载体（GFP-新霉素）并实现了在体外条件下活性与非活性sgRNA的比例为55%-45%，从而提高了筛选的敏感性和特异性（图2a）。
研究选择Yumm1.7 450R小鼠黑色素瘤细胞系作为模型，评估CRISPR-StAR在黑色素瘤靶点筛选方面的效果。该技术的一个显著优点是其内部控制机制能够克服批次效应，允许数据的累加采集。因此，全基因组筛选可以在两个独立批次（子库A和B）中分别进行，无论是体外还是体内实验（图2b）。特别地，通过在细胞移植后10天激活sgRNA，CRISPR-StAR可以专门检测完全建立的肿瘤中的基因功能，有效排除了体外生存能力和植入效率对筛选结果的影响（图2c）。这种方法确保了筛选结果更真实地反映体内环境下的基因行为，为揭示肿瘤生物学提供了强有力的支持。
图3：常规分析与CRISPR-StAR的基准分析
在体外筛选后进行的NGS和sgRNA库相对读取比较显示，靶向非必需基因（黑色）和必需基因（红色）的sgRNA之间存在明显的分离（图3a）。这表明我们的文库中的sgRNA是均匀分布的，为后续体内实验提供了坚实的基础。然而，在体内数据集中，活跃的测序读数跨越了五个数量级，即使没有特定基因靶向，也显示出广泛的分布（图3b），这突显了体内环境的复杂性。
当绘制体内活性读取与非活性读取的关系时，sgRNA显示出良好的分离性（图3b，右面板）。
研究人员将单个UMI的结果合并到基因水平，并使用MAGeCK方法计算基因效应，结果显示非必需基因如预期一样没有变化（图3c）。评估体内基因水平效果时，CRISPR-StAR的表现明显优于传统分析，具有更高的统计显著性（图3d）。进一步地，通过评估两个独立克隆的数据集之间的部分重叠，研究者们发现CRISPR-StAR在相隔两年生成的数据中依然保持了出色的重现性，R系数达到了0.54，远高于传统分析的0.14（图3e）。
为了进一步验证CRISPR-StAR的有效性，研究人员还进行了dAUC、ROC以及精确度召回率曲线的分析，以评估靶向IDG而非必需基因的引导物分离情况（图3f-h）。所有数据显示，CRISPR-StAR不仅在体外试点筛查中获得了优异的结果，而且在体内遗传筛选中也表现出了显著的改进。它有效地减轻了由数据稀疏性和异质性引起的噪音，增强了对体内基因功能的理解。
图4：治疗耐药性黑色素瘤中环境特异性基因的重要性
为了阐明体内和体外环境中特有的遗传依赖性，研究者将结果相互比较，并观察到在两种条件下核心必需基因与对照组之间明显的分离（图4a）。对体内比体外减少超过1.75倍的基因进行细胞成分分析显示，线粒体内膜相关基因（蓝色点；GO 0005743）有很强的过度代表。这包括编码三羧酸(TCA)循环、电子传递链、氧化等蛋白质的基因，磷酸化和线粒体核糖体。因此，体内观察到对氧化磷酸化的遗传依赖性。这些基因产物的遗传依赖性在公开可用的体外数据集中也没有被观察到（图4b）。
研究人员旨在验证具有明确偏倚的个体基因，这些基因在体内表现出更强的依赖性（这里称为“体内特异性”），并可能与治疗相关。基于列A中筛选结果，在体内LFC<<-2和体外LFC>- -1.5或体内LFC>22.5且至少有三个UMI的情况下，生成了一个包含80个假定体内特异性的必需基因（橙色）和23个假定体内特异性的基因（绿色）的验证库（图4c-e）。此外还纳入了对照组以及根据较低阈值标准确定的大约276个其他基因和属于线粒体呼吸链的112个基因。该库在体内外均进行了筛查（图4c和补充图1a）。
由于我们的耐药黑色素瘤细胞通常在体外存在达拉菲尼的情况下生长，而在体内不存在时，则我们在体外运行臂中加入了和未加入达拉芬尼的情况（图4d、e）。尽管TS在没有达拉芬尼的情况下也倾向于在体外富集，但整体上，必需基因在这条路径中的耗竭程度更低，这可能是由于在这种次优培养条件下减少了细胞周期所致。与Erk通路相关的基因脱颖而出，显示在体外对达拉芬尼高度敏感的选择，即Mapk1（也被称为Erk2）和Hsp90ab38，而负调节剂Stk40在此情况下显示出轻微的耗竭。对于提名的基因中分别显示为潜在富集或体内特异性耗竭的23个（52.2%，LFC>11）和80个（28.8%，LFC体内<<-1.5和LFC体外>11.5）基因，我们可以验证其特定背景下的依赖性。值得注意的是，包括在较低严格度阈值下的基因显示出了预期的明显较低的验证频率（45/267，16.3%）（补充图1b）。
同样地，我们也证实了对线粒体内膜基因的强烈体内特异性遗传依赖性。正如所料，我们根据较低严格度阈值将基因纳入验证集合，并未以相似的频率进行验证。总之，验证实验确认了CRISPR-StAR的实验效力和我们实施的验证集合中的纳入标准，并揭示了特定背景下的遗传依赖性，强调了体内遗传实验的相关性。
图5：遗传依赖性的跨物种验证
为了证实在Yumm450R小鼠黑色素瘤细胞中的发现，并评估人类治疗抵抗性黑色素瘤细胞是否也依赖于这些基因产物，研究人员试图同时在小鼠和人细胞系中评估验证基因集。鉴于CRISPR-StAR试验以可诱导的方式建立了肿瘤，并且考虑到基因通常以高度特定的上下文方式发挥作用，也测试了基因必要性是否扩展了用传统筛选范式检测到的肿瘤起始和生长。为此，将针对小鼠基因及其同源物的人类基因库克隆到一个CRISPR-StAR骨架以及一个构成性的sgRNA骨架中，并对敏感性和Braf抑制剂耐药的小鼠Yumm细胞和人类黑色素瘤（A375）进行了筛选。该常染色体筛查是重复进行的，我们还添加了4T1，一种小鼠乳腺癌细胞系，作为外部比较。YummR和A375中的CRISPR-StAR筛选如前所述（图5a）。
由于文库规模较小，仅针对导致每条sgRNA移植细胞中位数为116个和每个基因移植细胞中位数为575个的38个基因，因此可以启用构成性筛选。在常规臂中，我们利用了高文库覆盖率以及文库中存在的UMI，并分析了常规臂，包括相对于植入日的UMI丢失作为细胞死亡的替代表示（图5b）。正如预期的那样，在CRISPR-StAR中，所有测试的基因都显示YummR中的丢失。对于测试的两个A375细胞系来说，基本性也大多得到了证实，这表明体内必需基因是跨物种保守的。然而，传统结果并不总是与CRISPR-StAR结果相关。特别是，我们在成熟肿瘤中注意到Stk40和Zbtb10至少具有更明显的遗传依赖性，这是由CRISPR-StAR测定的。
图6：具有上下文特异性遗传依赖性基因的单基因验证
鉴于组成型和诱导型sgRNA之间的差异，研究人员接下来对CRISPR-StAR中识别的基因进行了单独验证。注意到他莫昔芬诱导未能导致StAR载体完全重组，这可能是由于肿瘤血管化不良所致。在NGS制备过程中，未重组事件通过重组特异性PCR扩增方法被排除在外。因此，构建了一个能够通过三种荧光素报告重组状态的载体（图6a）。
尽管对于中性对照，活性和非活性sgRNA的比例基本保持不变；而对于体内和体外的必需控制基因Tuba1b，活性sgRNA完全耗尽（图6b），所有其他基因在体内表现出比体外更强的依赖性（图6c）。值得注意的是，即使在体内可能有较少的细胞周期，这一现象仍然成立。特别是Zbtb10显示出了强烈的情境依赖性，这与验证筛选的结果相符（图4c-e）。Zbtb10和Stk40被证实为体内必需的，正如之前在CRISPR-StAR设置中所见，尽管在传统的筛选设置中没有观察到任何耗竭（图5b），这表明了强烈的上下文特异性。因此，在单个基因上，验证强烈支持CRISPR-StAR识别的特定环境功能。
CRISPR-StAR不仅仅适用于黑色素瘤的研究，其原理和技术可以应用于其他类型的癌症和其他疾病模型。
1.肿瘤免疫学
CRISPR-StAR技术在肿瘤免疫学领域展现出了巨大的潜力。通过体内筛选，研究人员可以识别出那些调控肿瘤微环境中免疫细胞活性的关键基因。例如，在T细胞介导的抗肿瘤反应中，CRISPR-StAR可以帮助科学家们确定哪些分子对于维持T细胞的功能至关重要，以及它们如何受到肿瘤相关信号通路的影响。此外，该技术还可以用来探索巨噬细胞、自然杀伤细胞等其他免疫细胞类型对肿瘤发展的作用，从而为开发新型免疫疗法提供理论依据。
2.神经科学
神经系统的复杂性和多样性使得传统方法难以全面解析其内部机制。CRISPR-StAR技术允许研究者在单细胞水平上追踪神经元之间的相互作用及其响应外界刺激的方式。比如，在阿尔茨海默病的研究中，利用这项技术可以揭示β-淀粉样蛋白沉积如何影响特定亚型神经元的命运；而在帕金森病方面，则可用于探究多巴胺能神经元丧失背后的遗传因素。更重要的是，CRISPR-StAR还能够帮助我们理解神经发育过程中的细胞命运决定机制，这对于治疗先天性神经系统疾病具有重要意义。
3.心血管疾病
心血管系统是一个高度协调的整体，涉及心脏、血管等多个器官间的密切配合。CRISPR-StAR技术的应用将有助于揭示这些组织内部复杂的细胞间通信网络，并发现新的治疗靶点。以动脉粥样硬化为例，该技术可以帮助科学家们鉴定出促进斑块形成或稳定化的关键分子，进而设计出更为有效的干预措施。同时，在心肌梗死后的修复过程中，CRISPR-StAR也可以用于寻找促进心脏再生和功能恢复的相关基因，为改善患者预后提供新思路。
4.代谢性疾病
代谢性疾病如糖尿病、肥胖症等往往伴随着全身性的代谢紊乱，因此需要从整体角度出发进行研究。CRISPR-StAR技术能够在动物模型中模拟人类疾病状态，精确地操控不同组织中的特定基因表达，从而更好地模拟病理生理条件。例如，在胰岛β细胞中使用CRISPR-StAR来调整葡萄糖感应器GLUT2的水平，可以观察到血糖调节的变化；而在脂肪组织中改变脂质合成酶ACC1的活性，则有助于了解脂肪积累的过程。此外，该技术还可以应用于肝脏、肌肉等多种代谢活跃组织，为深入探讨代谢性疾病的发生机制及寻找潜在药物靶点提供了强有力的支持。
5.干细胞生物学
干细胞具有自我更新和分化成多种细胞类型的特性，在组织修复和再生医学中扮演着核心角色。CRISPR-StAR技术可以用来研究干细胞在体内的行为模式，包括它们如何响应微环境变化而选择不同的分化路径。例如，在肠道类器官培养系统中应用CRISPR-StAR，不仅可以观察Lgr5+干细胞如何构建隐窝-绒毛结构，还能进一步探索Wnt信号通路在这个过程中所起的作用。这不仅加深了我们对正常生理条件下干细胞功能的理解，也为癌症干细胞理论提供了实验证据。
6.细胞竞争与进化
细胞竞争是生物体维持内稳态的一种重要机制，它确保了健康细胞能够淘汰掉不适应生存条件的细胞。CRISPR-StAR技术可以通过创建携带特定sgRNA组合的细胞群体，来模拟自然界中存在的细胞竞争现象。此外，该技术还可以应用于研究细胞适应压力环境的能力，以及在此过程中发生的快速进化事件，这对于理解物种适应性演化规律同样有着不可忽视的价值。
CRISPR-StAR技术的出现对于临床医生和科研人员来说是一个重大进步。它可以帮助我们更深入地了解癌症等复杂疾病的分子机制，发现新的药物靶点，并指导精准治疗策略的选择。
注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。
参考文献：
Uijttewaal ECH, Lee J, Sell AC, Botay N, Vainorius G, Novatchkova M, Baar J, Yang J, Potzler T, van der Leij S, Lowden C, Sinner J, Elewaut A, Gavrilovic M, Obenauf A, Schramek D, Elling U. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 2024 Dec 16.